1. OBJETIVO
- Separar e
identificar los azúcares que se encuentran en la muestra desconocida.
2. MARCO TEÓRICO:
La cromatografía
es una técnica de separación extraordinariamente versátil que presenta distintas
variantes. En toda separación cromatográfica hay dos fases (sólida, líquida o
gas) una móvil y otra estacionaria, que se mueven una con respecto de la otra
manteniendo un contacto íntimo. La muestra se introduce en la fase móvil y los
componentes de la muestra se distribuyen entre la fase estacionaria y la móvil.
Los componentes de la mezcla a separar invierten un tiempo diferente en
recorrer cada una de las fases, con lo que se produce la separación. Si un
componente está la mayor parte del tiempo en la fase móvil el producto se mueve
rápidamente, mientras que si se encuentra la mayor parte en la fase
estacionaria, el producto queda retenido y su salida es mucho más lenta.
Tanto los
azúcares como los aminoácidos pueden ser identificados por diferentes métodos:
a. Reacciones de coloración.
b. Colorimetría. Por ejemplo: glucosa en sangre.
c. Electroforesis. Por ejemplo: para las proteínas
plasmáticas.
d. Diferentes tipos de cromatografía: Fundamentándose
en los principios ya comprendidos de cromatografía es posible entender el
desarrollo de la técnica de cromatografía en papel.
La cromatografía
en papel se utiliza para compuestos muy polares o poli-funcionales. El uso más
común es para azúcares, aminoácidos y pigmentos naturales. En esta
cromatografía se utiliza el fenómeno de partición en donde la fase estacionaria
se halla sobre un soporte activo (el papel) que en realidad forma parte de la
fase estacionaria que es el agua. Las fases móvil y estacionaria estarán en
contacto en una gran interfase, lo que permite una rápida obtención de una
distribución de equilibrio del soluto entre ellas. Si la muestra problema está
formada por más de un soluto, éstos se separan por sus diferentes coeficientes
de partición.
La realización
de la cromatografía en papel implica la siembra de la muestra problema en un
trozo de papel de buena calidad, en general Whatman N°1 para cromatografía
analítica, que luego se
introducirá en una cuba de desarrollo de modo que el solvente (fase móvil)
ascienda por capilaridad (técnica ascendente) o descienda por capilaridad y
gravedad (técnica descendente). La fase estacionaria es un complejo celulosa -
agua que tiene un poder diferente que el del agua pura.
Etapas de la
cromatografía en papel
Siembra: Se aplican muestras en
solución a no menos de 1,5 cm del borde inferior de una tira rectangular de
papel, y a no menos de 1,5 cm de los bordes laterales, manteniendo a su vez,
entre mancha y mancha una distancia no menor de 1 cm. Se hace un toque, se evapora
el solvente, se hace otro toque, tratando de concentrar la muestra sin superar
un diámetro de la mancha de 3 mm. La siembra es puntual para fines analíticos,
y en banda para fines preparativos.
Desarrollo:
- Ascendente: el solvente se coloca en el fondo de la cuba y el papel se suspende
colocado en la parte superior de la cuba.
- Descendente: el solvente se coloca en un depósito inerte ubicado en la parte
superior de la cuba cromatográfica. En el fondo de la cuba se coloca
también un poco de solvente para asegurar la saturación con el vapor. La
parte superior del papel se sumerge en el disolvente y se tapa
herméticamente la cuba (al igual que en la técnica ascendente). La siembra
quedará en la parte superior del papel.
- Bidimensional:
se corre el papel en una dirección y luego del desarrollo y secado se gira
90° y se corre con otro solvente.
Revelado: Si los compuestos de la
mezcla son coloreados, las manchas son visibles directamente. De lo contrario
habrá que revelarlas.
Luz UV: si los
compuestos absorben esta radiación las manchas se verán con fluorescencia.
Reactivos de
color: especiales para cada compuesto. Se deberá tener en
cuenta que no se pueden usar reveladores que destruyan el papel como el ácido
sulfúrico o el calor.
Vapores de yodo
sublimado: es un revelador universal.
Evaluación: Se efectúa el cálculo
del Rf para cada componente de la mezcla por separado, que es
característico de cada compuesto en condiciones constantes: soporte,
temperatura, solventes, altura de desarrollo.
Distancia
recorrida por el compuesto desde el origen o punto de siembra.
Rf = ,𝒙-𝒚.
El Rf toma
valores entre 0 y 1 y puede ser usado para la identificación de los componentes
de una muestra, siempre y cuando se trate de sistemas cromatográficos idénticos.
3. PROCEDIMIENTO:
4. CÁLCULOS:
FACTOR DE RETENCIÓN
- ESTÁNDAR GLUCOSA
Rf = xy
Rf = 0.323
- ESTÁNDAR
FRUCTOSA
Rf = xy Rf = 0.367
- ESTÁNDAR SACAROSA
Rf = xy
Rf =
0.345
- ESTÁNDAR MALTOSA
Rf = xy
Rf = 0.213
- MUESTRA DESCONOCIDA
Rf =
xy
Rf = 0.375
5. RESULTADOS:
|
AZÚCARES
ESTÁNDAR
|
X(cm)
|
Y(cm)
|
FACTOR DE
RETENCIÓN (Rf)
|
|
GLUCOSA
|
44
|
136
|
0.323
|
|
FRUCTOSA
|
50
|
136
|
0.367
|
|
SACAROSA
|
47
|
136
|
0.345
|
|
MALTOSA
|
29
|
136
|
0.213
|
|
MUESTRA DESCONOCIDA
|
X(cm)
|
Y(cm)
|
FACTOR DE
RETENCIÓN Rf
|
|
k
|
51
|
136
|
0.375
|
6. RESULTADOS PRÁCTICOS
7. DISCUSIÓN
El solvente utilizado permite una
buena separación de los azúcares.
El papel cromatográfico utilizado
no es el conveniente ya que no se aprecia una clara movilidad de las muestras.
8. CONCLUSIÓN
En la muestra problema se
encontró 3 tipos diferentes de azúcares identificadas y uno no identificado
(glucosa, fructosa, sacarosa).
LINKOGRAFIA:
http://www.buenastareas.com/ensayos/Cromatografia-De-Azucares/2965987.html